Cómo biólogos leen un gen con la secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN, que determina el orden de los nucleótidos en una cadena de ADN, permite a los científicos para leer el código genético para que puedan estudiar las versiones normales de genes. También les permite hacer comparaciones entre las versiones normales de un gen y las versiones que causan enfermedades de un gen.

Después de que ellos saben el orden de los nucleótidos en las dos versiones de un gen, pueden identificar qué cambios en el gen causa la enfermedad.

La secuenciación del ADN se basa en un tipo especial de nucleótidos, llamado ddNTP (abreviatura de trifosfato dideoxiribonucleótido). ddNTPs son algo similares a los nucleótidos de ADN regulares, pero son lo suficientemente diferentes que dejen de replicación del ADN.

Cuando se añade un ddNTP a una cadena creciente de ADN, ADN polimerasa no puede añadir más nucleótidos por lo que la cadena en crecimiento se detiene en ese punto. La secuenciación del ADN utiliza esta interrupción de cadena para determinar el orden de los nucleótidos en una cadena de ADN.

La mayoría de secuenciación de ADN es hecho hoy ciclo de secuenciación (que se muestra en la figura), un proceso que funciona como PCR para crear muchas copias del gen se secuenció. Pero, a diferencia de PCR, se añaden ddNTPs así como nucleótidos regulares a la mezcla. Así que, como la ADN polimerasa trabaja lejos de hacer muchas copias del gen, de vez en cuando se agarra un ddNTP (mostrado como rectángulos blancos) en lugar de un nucleótido normal (mostrado como rectángulos negros).

Después de un ddNTP se añade a una molécula de ADN en crecimiento, se detiene la replicación. El resultado final de la secuenciación del ciclo es un montón de copias parciales del gen para ser secuenciados, todas las cuales se detuvo en diferentes puntos y, por tanto diferentes longitudes.

Después se realizan las copias parciales, los científicos los cargan en una máquina que utiliza electroforesis en gel para poner las copias en orden por tamaño. Como las secuencias parciales pasan a través de la máquina, un láser lee una etiqueta fluorescente en cada ddNTP, que revela el orden de los nucleótidos en el gen.

Pon a prueba tu comprensión de lectura ddNTP con estas preguntas de práctica:

1. Un científico quiere determinar la secuencia de un gen asociado con una enfermedad genética. Ella toma muestras de ADN una persona que tiene la versión causante de la enfermedad del gen en cuatro tubos separados de prueba, cada uno conteniendo nucleótidos, ADN polimerasa y cebadores.

   Entonces, en cada tubo, se añade un tipo de didesoxinucleótido - ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP - de manera que cada tubo producirá fragmentos de ADN que terminan con un nucleótido en particular (A, G, C, o T). Después de ejecutar las reacciones de secuenciación, que carga los resultados de cada tubo en un gel y separa los fragmentos usando electroforesis en gel.

   Basándose en los resultados en su gel, que se muestra en esta figura, ¿cuál es la secuencia del gen?

   

2. Una mujer joven cuya madre murió a causa de la aparición temprana de Alzheimer quiere saber si está en riesgo de desarrollar la enfermedad. La enfermedad es causada por un alelo dominante, por lo que si la mujer tiene sólo una única copia de los alelos que causan enfermedades, que va a desarrollar la enfermedad.

   Describa cómo un científico podría usar una muestra de sangre de la joven a la pantalla ella por la presencia de los alelos que causan enfermedades. Asegúrese de incluir todas las técnicas necesarias, empezando por la muestra de sangre.

   Las siguientes son las respuestas a las preguntas de práctica.

3. ADN viaja hacia el electrodo positivo en un gel, y los fragmentos más pequeños se mueven la mayor distancia, por lo que las bandas en el gel que son más cercano a la + son las bandas más pequeñas.

   El fragmento más corto (la banda más baja) está en el carril que se cargó con ddCTPs, por lo que el primer nucleótido en la cadena de ADN debe ser C. La siguiente banda es en el carril que se cargó con ddTTPs, por lo que el siguiente nucleótido debe ser T .

   La siguiente banda está de nuevo en el carril de la C, por lo que el siguiente nucleótido debe ser una C. Si continúa leyendo el gel desde el lado + hacia el lado - - en otras palabras, desde el fondo hasta la parte superior - se puede averiguar el resto de la secuencia de ADN. Toda la secuencia es CTC AGC CAT AGG.

4. El científico sería extraer el ADN de la muestra de sangre y luego utilizar la secuenciación del ADN o enzimas de restricción para determinar si la mujer joven lleva los alelo causante de enfermedad.

   ADN método de secuenciación: El científico lee las secuencias de alelos de la joven y las compara con las secuencias conocidas de los alelos normales y de enfermedad. El científico separa muestra de ADN de la joven y lo coloca en cuatro tubos. Cada tubo contiene cebadores para el gen de Alzheimer y un montón de nucleótidos.

   Uno de cada tubo contiene un ddNTP marcado con fluorescencia diferente: una con ddATP, uno con ddCTP, uno con ddGTP, y uno con ddTTP. El científico coloca los tubos en un secuenciador de ciclo, donde pasan por muchas rondas de replicación del ADN.

   Entonces el científico ejecuta las muestras a través de un gel que los separa por tamaño. El ordenador detecta la señal fluorescente en el extremo de cada trozo de ADN de menor a mayor y lo utiliza para reconstruir las secuencias de ADN para los alelos de la joven.

   Restricción método enzimático: El científico utiliza PCR sobre el ADN de la sangre para hacer muchas copias del gen asociado con la enfermedad de Alzheimer. Entonces el científico utiliza una enzima de restricción que es conocido para cortar de manera diferente dentro de las formas normales y de enfermedad del gen.

   El científico corta muestra de la joven de ADN con la enzima de restricción y luego separa el ADN mediante electroforesis en gel. El científico compara los tamaños de los fragmentos de ADN producidos por el ADN de la mujer joven con el patrón conocido generado por los alelos normales y de enfermedad.